全面揭示豬肺部抗生素抗性基因的組成、宿主細菌、轉移的可能路徑及其與呼吸道病變的關系
2023年8月12日，江西農業大學豬遺傳改良與種質創新全國重點實驗室黃路生院士團隊在國際重要學術刊物“自然子刊”Nature Communications在線發表題為“Characterization of the pig lower respiratory tract antibiotic resistome”（Doi: 10.1038/s41467-023-40587-1）的重要研究成果。該成果提供了首個豬下呼吸道微生物抗生素抗性基因（ARGs）圖譜，描繪了豬下呼吸道耐藥組特征，解析了抗生素抗性基因通過可移動遺傳原件介導的在豬下呼吸道、腸道和人下呼吸道微生物之間的水平傳播，本論文還首次研究了豬下呼吸道耐藥組與肺部病變的關系。中國科學院院士、中國畜牧獸醫學會理事長、江西農業大學豬遺傳改良與種質創新全國重點實驗室主任黃路生，江西農業大學首席教授陳從英為共同通訊作者，江西農業大學周云燕博士、李井泉博士、黃菲博士為共同第一作者。
圖：豬肺部和氣管抗生素抗性基因組成比較
背景介紹：抗生素耐藥性已成為全球人類健康的一大威脅。豬呼吸道疾病是養豬業面臨的主要挑戰之一，由于潛在的交叉感染風險，對人類健康也有重要影響。每年有大量抗生素用于豬呼吸道疾病的治療，但目前豬的抗生素耐藥性研究主要聚焦于腸道微生物，呼吸道微生物抗生素耐藥組的特征及其與肺部健康的關系尚不清楚。了解豬呼吸道微生物組中抗生素抗性基因的組成、分布及其水平傳播途徑不僅可以指導豬呼吸道疾病治療中抗生素的使用，對人類健康及生態環境保護也有重要意義。
主要創新：項目組用12年時間構建的由全世界四個不同商業品種及四個中國地方豬種混合雜交而成，且有精細肺部病變表型測定記錄的嵌合家系第七世代群體為主要研究群體，結合實驗室培育的獲國家認定的“山下長黑”豬新品種，中國地方豬種二花臉、藏豬以及野豬等實驗豬群體，測定了肺部和氣管兩個下呼吸道部位共計745個微生物樣本，通過高深度宏基因組測序，取得了五個方面的創新性研究成果：
一、系統分析了豬下呼吸道微生物抗生素抗性基因的組成與分布，提供了首個豬下呼吸道微生物抗生素耐藥組和可移動元件圖譜。
從745個豬下呼吸道微生物樣本中共鑒定到1228個編碼抗生素抗性蛋白的開放閱讀框（ORF），這些開放閱讀框屬于372種抗生素抗性基因類型和24種耐藥類型。四環素類（33%）、氨基糖苷類（22%）抗性基因是豬下呼吸道最豐富的抗性基因類型。豐度最高的5種抗性基因是floR、tet(39)、tet(L)、tetQ和tet(D)，在樣本中分布最廣的5種抗性基因是adeF、floR、tet(W/N/W)、APH(6)-Id和tetQ。幾種重要的抗性基因，如sul1、Ermb和mcr在豬下呼吸道微生物組中存在較多的變體。
發現肺部微生物的抗性基因和可移動遺傳元件的數量、總豐度和α多樣性均顯著高于氣管，且β多樣性也存在顯著差異。共鑒別到40個抗性基因在肺部和氣管微生物組中存在顯著的豐度差異。不同豬種間抗性基因和可移動遺傳元件的數量、總豐度和α多樣性差異不顯著，但β多樣性存在顯著差異。
二、發現了抗性基因與可移動遺傳元件間的緊密聯系，揭示了抗性基因在豬肺部和腸道微生物組以及人類肺部微生物組之間的潛在水平轉移途徑。
從抗性基因與可移動遺傳元件間緊密聯結（處于同一contig的 5 kb相鄰范圍內）以及共豐度兩種方法鑒別到抗性基因與可移動遺傳元件間的緊密聯系，發現可移動遺傳元件Tn916家族和四環素類抗性基因（尤其是tetM）、tnpA和多種不同類型抗性基因間緊密相關，提示Tn916家族和tnpA在相關抗性基因水平傳播中起重要作用。利用課題組前期從豬腸道中組裝得到的6339個微生物基因組數據（Nature Communications, 2021, 12: 1106. Doi：10.1038/s41467-021-21295-0）以及公共數據庫中人類肺部微生物宏基因組測序數據，發現Tn916家族和tetM、tnpA和多種不同類型抗性基因間的緊密聯系在豬腸道和人類肺部微生物中也存在。利用從人類和豬中分離得到的7種常見耐藥菌的3878個基因組數據，發現幾乎所有攜帶了tetM抗性基因的基因組同時也攜帶了Tn916家族基因。除tetM外，在Enterococcus faecalis 和Enterococcus faecium的部分菌株中還發現了Tn916家族與四環素抗性基因tet45、tet(W/N/W)間的緊密相關性。同時也驗證了tnpA和不同類型抗性基因之間的緊密聯系。這些結果提示Tn916家族和tnpA可在不同細菌種類中介導抗性基因在機體不同部位以及人類與豬之間的水平轉移。
三、系統鑒別了抗生素抗性基因的宿主細菌，為肺部疾病治療中抗生素使用提供參考。
研究發現γ變形菌綱（Gammaproteobacteria）是抗性基因的主要攜帶者，包含53%的抗性基因，其中大腸桿菌基因組上攜帶的抗性基因數量超過50個，可移動遺傳元件數量超過 10個。有些抗性基因（如floR）的宿主細菌分布廣泛甚至跨越不同的門。
四、首次揭示了肺部微生物抗生素抗性基因與肺部病變間的關系。
在613個精細測定了不同肺部病變程度（健康肺、輕度病變、中度病變和重度病變）個體中分析了抗生素抗性基因組成和豐度與肺部病變的關系，發現隨著肺部病變程度增加，抗性基因組成的α多樣性下降，進一步分析發現豬下呼吸道耐藥組的組成主要由微生物群落的組成而不是肺部病變嚴重程度塑造。同時，還鑒別到73個抗性基因在不同病變程度豬肺中存在顯著豐度差異。
五、深度宏基因組測序分析發現可移動遺傳元件也能介導豬肺炎支原體毒力因子的水平轉移，提示豬肺炎支原體感染風險。
研究發現豬肺炎支原體的平均豐度占肺部細菌總豐度的46%，且肺炎支原體豐度與豬肺部病變嚴重程度相關。然而，本研究組裝得到以及公共數據庫下載的共計30個豬肺炎支原體的基因組中均未鑒別到抗生素抗性基因，卻發現其存在9個毒力因子，其中7個毒力因子具有細胞粘附功能，在這些毒力因子的臨近區域同時還鑒定到可移動遺傳元件的存在，包括前噬菌體、tnpA、IS91等，提示毒力因子可通過不同類型的移動遺傳元件在菌株間水平轉移，促進肺炎支原體的感染。
研究意義：本研究提供了首個豬肺部及氣管微生物組的抗生素抗性基因集，揭示了豬肺部不同微生物攜帶的潛在可移動遺傳元件介導的抗生素抗性基因在不同部位以及人類與豬之間的水平轉移，全面鑒定了肺部抗生素抗性基因的宿主細菌，分析了抗性基因與肺部病變的關系。研究結果可為我國生豬生產中呼吸道疾病的治療中抗生素的使用提供參考，對健康豬肉生產以及環境友好養殖保障具有重要意義。此外，人體肺部微生物樣本采集困難，豬肺是人類肺部疾病研究良好的生物醫學模型，且其微生物組成與人類肺部微生物組成具有一定的相似性，本研究構建的豬肺部及氣管微生物組抗性基因圖譜也可為人類下呼吸道微生物組抗性基因研究以及人類肺部疾病治療中抗生素使用提供參考。
供稿：科技處 編發：宣傳部
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